根据临床症状和病理剖检变化，结合流行病学分析可做出初步诊断，查出病原菌才具有确诊意义。
以无菌操作法采取病死鸡皮下渗出液、关节腔渗出液或雏鸡卵黄囊，以及内脏器官如肝、脾、肾可作为金黄色葡萄球菌分离培养的病料。接种培养基，同时涂片、染色镜检。如果从典型的病灶中分离到革兰氏阳性单在或排列成短链状球菌，可作为快速的初步鉴定。
金黄色葡萄球菌在普通琼脂和血液琼脂（绵羊血或牛血）上生长良好，对于污染严重的病料，可以用高盐培养基，如甘露醇－高盐琼脂培养基，以抑制革兰氏阴性细菌的生长。根据在固体培养基上典型的菌落形态、色素产生情况、溶血情况，镜检时典型的葡萄串状的排列方式，很容易确诊为金黄色葡萄球菌。
由于葡萄球菌常常是健康正常禽菌群的一部分，所以仅仅分离出葡萄球菌的本身并不能作为葡萄球菌病完全的诊断证据，还需做致病性和非致病性葡萄球菌的区别。一般致病性葡萄球菌血浆凝固酶试验阳性，产生金黄色色素，在血液琼脂上呈β-型溶血，发酵甘露糖，而非致病性葡萄球菌上述几项试验为阴性。
近几年来有利用PCR技术、核酸探针、ELISA方法等检测葡萄球菌的毒素基因和抗原物质。这些方法特异性强、灵敏度高，但需一定设备条件才能推广应用。